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轉盤超分辨活細胞成像技術SpinSR

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2017/11/7 瀏覽次數：

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通過以往的介紹，我們初步了解了共聚焦激光掃描顯微成像技術（Confocal Laser Scanning Microscopy, CLSM）和雙轉盤式共聚焦成像技術（Spinning Disk Confocal）。與點掃描共聚焦較大的區別是，轉盤共聚焦同時掃描多個激光焦點，然后通過面陣檢測器(area detector)比如CCD/sCMOS/EMCCD相機來高速采集圖像信號。這樣，整體成像速度得到了極大提高，同時也能減少對樣品的光漂白光毒性。因此轉盤共聚焦特別適合用于活細胞共聚焦成像。

光學超分辨

由于光學衍射的限制，熒光顯微鏡在細胞生物學里能觀察到的亞細胞結構局限于200nm左右，需要有更高的光學分辨率來解析這些結構。過去的十幾年，光學超分辨技術發展得如火如荼，

photoactivatable localization microscopy (PALM; Betzig 2006), stochastic optical reconstruction microscopy (STORM; Zhuang 2006), 以及 stimulated emission depletion microscopy (STED; Hell 1994) 可以將光學分辨率提高至50nm，但是PALM/STORM/STED技術在成像速度上滿足不了活細胞的成像需求，同時由于原理上的限制，現階段有些現有生物熒光樣品還不能使用這些超分辨技術。還有一種成像技術structured illumination microscopy (SIM; Heintzmann and Cremer, 1999) 可以將分辨率提到到120nm左右，并且對于生物熒光樣品的限制不多，普通熒光顯微鏡或者共聚焦顯微鏡能用的樣品在SIM系統上也能使用。但是，SIM技術在成像速度上的改進不是很多，提高到11幀/秒，因為需要9至15幀左右的原始圖像來重建一幅SIM圖像。在此基礎上，3D-SIM可以將軸向分辨率提高到100-200nm。但是大部分情況下，SIM成像深度局限在10 - 20um，而且SIM圖像重建時容易產生條紋狀瑕疵。

技術名稱	XY軸分辨率	Z軸分辨率	速度	染料	檢測器
Confocal	200	500	ms·s	所有	PMT/APD
TIRF	200	100	ms	所有	CCD/sCOMOS
SIM	130	250	ms	大部分	CCD/sCOMOS
STED	85	560	ms·min	有局限	PMT/APD
PALM/STORM	25	100	min	有局限	CCD/sCOMOS

針對活細胞/活組織顯微成像，轉盤共聚焦有非常大的優勢，極低的光毒性和光漂白對于長時程熒光成像有很大的幫助。如果有一種技術，既能夠保留轉盤共聚焦的優勢，又能夠在特定的實驗需求時提供更高的光學分辨率，那對于生命科學領域內的很多顯微成像實驗將帶來革命性的變化。

轉盤共聚焦 + 光學超分辨

Spinning-disk based Super-Resolution采用Yokogawa CSU-W1掃描頭，可以在寬場熒光Widefield、轉盤共聚焦Confocal、以及轉盤超分辨SpinSR三個模式之間自由切換。這種情況下，可以根據實驗的具體需求來選擇更適合的成像模式，也有些時候需要拍攝兩種模式下的熒光圖像以此來確認具體哪種技術更適合樣品。

那么，基于轉盤共聚焦的超分辨是如何實現的呢？從廣義上講，轉盤在高速掃描的時候，使激光在樣品上也形成了類似SIM的結構光照明。和傳統SIM技術不同的是，轉盤SR技術在科研顯微相機檢測之前將熒光信號通過一樣的條紋結構，從而實現信號的解調制；傳統SIM技術在相機前沒有解調制，需要三張甚至更多的原始圖像來重建SIM超分辨圖像。